ΑΣΚΗΣΗ ΜΕ PCR (4 κεφάλαιο κατεύθυνσης)

Θέλουμε να πάρουμε 600 αντίγραφα ενός τμήματος DNA , μήκους 20000 ζευγών βάσεων , με την μέθοδο αντιγραφής P.C.R. Αν ένας κύκλος αντιγραφής διαρκεί 5 λεπτά , να υπολογιστούν :

α) Πόσοι κύκλοι αντιγραφής πρέπει να πραγματοποιηθούν (τουλάχιστον ) ;

β)  Πόσος χρόνος θα απαιτηθεί για την πραγματοποίηση των παραπάνω κύκλων  αντιγραφής ;

γ)  Πόσα νουκλεοτίδια θα χρησιμοποιηθούν και πόσοι  φωσφοδιεστερικοί δεσμοί θα δημιουργηθούν από την DNA πολυμεράση (taq πολυμεράση) κατά την πραγματοποίηση όλων των παραπάνω κύκλων ;

δ) Αν αφήσουμε την PCR για 35 κύκλους αντιγραφής , πόσα μόρια DNA θα δημιουργηθούν ;

ε) Κατά την PCR αντί τη χρήση της DNA ελικάσης χρησιμοποιούμε θέρμανση στους 94 – 95 ^οC 30 sec ή 1min . Τι επιδιώκουμε με την θέρμανση και πως θα χαρακτηρίζατε το τμήμα αυτό της διαδικασίας ;

ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΟΥ - ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ (4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ))

ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ (4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ)

ΑΣΚΗΣΗ ΜΕ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ

Σε ένα βιοτεχνολογικό εργαστήριο οι επιστήμονες θέλουν να κατασκευάσουν ένα ανασυνδιασμένο πλασμίδιο . Για το σκοπό αυτό διαθέτουν δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες , την EcoRI και την HindIII , ένα πλασμίδιο και ένα μόριο DNA που περιέχει το γονίδιο που θέλουν να ενσωματώσουν στον φορέα κλωνοποίησης  .

Η HindIII αναγνωρίζει την αλληλουχία                  

5΄AAGCTT  3΄

3΄TTCGAA 5΄

                                                                                                                                                                          

 και κόβει ανάμεσα στις διαδοχικές

αζωτούχες βάσεις ΑΑ .Το πλασμίδιο που διαθέτουν στο εργαστήριο  η EcoRI το κόβει σε δύο κομμάτια , ενώ η HindIII σε ένα μόνο κομμάτι .Επίσης και οι δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες  αναγνωρίζουν περιοχές και στα δύο άκρα του γονιδίου .Να απαντήσετε στις παρακάτω ερωτήσεις :

α) Ποια αλληλουχία αναγνωρίζει η EcoRI και πόσες φορές υπάρχει η αλληλουχία αυτή στο πλασμίδιο ;

β) 1) Πόσοι και ποιοι δεσμοί σπάνε στο πλασμίδιο μετά τη δράση της EcoRI ;

     2) Πόσοι και ποιοι δεσμοί σπάνε στο πλασμίδιο μετά τη δράση της HindIII ;

γ) Ποια από τις δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες θα χρησιμοποιηθεί από τους επιστήμονες για το κόψιμο του πλασμιδίου και ποια για την απομόνωση του γονιδίου ; Αιτιολογείστε την απάντησή σας .

δ)  Αν το θραύσμα που περιέχει το γονίδιο , μετά το κόψιμο του , αποτελείται από 1000 νουκλεοτίδια και οι G στο θραύσμα είναι 302 , να υπολογιστούν οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και οι δεσμοί υδρογόνου του θραύσματος .

ε) Πόσοι δεσμοί και ποιοι δημιουργούνται με την ένωση του θραύσματος που περιέχει το γονίδιο , με το κομμένο πλασμίδιο ; Ποιους από αυτούς τους δεσμούς ,τους δημιουργεί η DNA δεσμάση που χρησιμοποίησαν οι βιοτεχνολόγοι  για την κατασκευή του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου ;

ΣΤΕΡΕΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

ΤΡΥΒΛΙΟ PETRI - ΣΤΕΡΕΟ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ-ΑΠΟΙΚΙΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ

ΑΣΚΗΣΗ ΜΕ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΑΝΑΣΥΝΔΙΑΣΜΕΝΟΥ DNA

Το παρακάτω τμήμα DNA  περιέχει ένα γονίδιο που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση ενός  ολιγοπεπτίδιου .

3΄ CGAGCTCGGATCGTCTTAAGCTTGTACGTCAGCTAA  5΄

5΄ GCTCGAGCCTAGCAGAATTCGAACATGCAGTCGATT 3΄

Για την απομόνωση του γονιδίου , έχουμε στην διάθεσή μας δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες , την

EcoRI και την TaqI  που αναγνωρίζει την αλληλουχία : 5΄ TCGA  3΄                                                                                                                   3΄ AGCT  5΄

       και κόβει μεταξύ Τ και C .

Να απαντήσετε στις παρακάτω ερωτήσεις και να τις αιτιολογήσετε .

α) Ποια από τις δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες θα χρησιμοποιηθεί και πόσα θραύσματα θα δημιουργηθούν από το κόψιμο του τμήματος αυτού;

β) Να γράψετε το θραύσμα που περιέχει το γονίδιο που θέλουμε να κλωνοποιηθεί .

γ) Να σχεδιάσετε το ανασυνδιασμένο πλασμίδιο και στο σχήμα να φαίνεται το θραύσμα με το γονίδιο και τα σημεία ένωσής του με το κομμένο πλασμίδιο .

δ) Να γράψετε το μεταφραζόμενο τμήμα του γονιδίου , με τον προσανατολισμό του .

ε) Να βρείτε , με τη χρήση του γενετικού κώδικα , το πεπτίδιο που παράγεται .