ΑΣΚΗΣΗ ΜΕ ΠΕΡΙΟΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ

Σε ένα βιοτεχνολογικό εργαστήριο οι επιστήμονες θέλουν να κατασκευάσουν ένα ανασυνδιασμένο πλασμίδιο . Για το σκοπό αυτό διαθέτουν δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες , την EcoRI και την HindIII , ένα πλασμίδιο και ένα μόριο DNA που περιέχει το γονίδιο που θέλουν να ενσωματώσουν στον φορέα κλωνοποίησης  .

Η HindIII αναγνωρίζει την αλληλουχία                  

5΄AAGCTT  3΄

3΄TTCGAA 5΄

                                                                                                                                                                          

 και κόβει ανάμεσα στις διαδοχικές

αζωτούχες βάσεις ΑΑ .Το πλασμίδιο που διαθέτουν στο εργαστήριο  η EcoRI το κόβει σε δύο κομμάτια , ενώ η HindIII σε ένα μόνο κομμάτι .Επίσης και οι δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες  αναγνωρίζουν περιοχές και στα δύο άκρα του γονιδίου .Να απαντήσετε στις παρακάτω ερωτήσεις :

α) Ποια αλληλουχία αναγνωρίζει η EcoRI και πόσες φορές υπάρχει η αλληλουχία αυτή στο πλασμίδιο ;

β) 1) Πόσοι και ποιοι δεσμοί σπάνε στο πλασμίδιο μετά τη δράση της EcoRI ;

     2) Πόσοι και ποιοι δεσμοί σπάνε στο πλασμίδιο μετά τη δράση της HindIII ;

γ) Ποια από τις δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες θα χρησιμοποιηθεί από τους επιστήμονες για το κόψιμο του πλασμιδίου και ποια για την απομόνωση του γονιδίου ; Αιτιολογείστε την απάντησή σας .

δ)  Αν το θραύσμα που περιέχει το γονίδιο , μετά το κόψιμο του , αποτελείται από 1000 νουκλεοτίδια και οι G στο θραύσμα είναι 302 , να υπολογιστούν οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και οι δεσμοί υδρογόνου του θραύσματος .

ε) Πόσοι δεσμοί και ποιοι δημιουργούνται με την ένωση του θραύσματος που περιέχει το γονίδιο , με το κομμένο πλασμίδιο ; Ποιους από αυτούς τους δεσμούς ,τους δημιουργεί η DNA δεσμάση που χρησιμοποίησαν οι βιοτεχνολόγοι  για την κατασκευή του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου ;